转自：阳光诺和

在创新药物研发的全链条中，细胞水平的生物学分析是衔接分子机制与临床疗效的核心环节。阳光德美实验室依托符合GLP/GCP标准的细胞分析平台，整合细胞转染与构建、Cell-based ELISA、流式细胞术（FCS）表型分析、细胞免疫ELISpot技术、胞内细胞因子染色（ICS）等前沿技术，为化学创新药、多肽类药物、单/多抗类生物制品、核酸类药物、细胞治疗类药物等的药代动力学、药效学、免疫原性及中和抗体等研究提供多维度的细胞级洞察。

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技术应用

• Cell-based ELISA

也称作In-Cell ELISA或In-Cell Western，是一种基于细胞水平的免疫检测技术，能够在完整细胞内直接定量目标蛋白或蛋白修饰（如磷酸化）。其检测原理是将细胞接种到96孔板中，经刺激或抑制处理后，对细胞进行固定透化，使抗体能够进入细胞内。接着加入一抗和二抗孵育、显色，最后测量信号。与传统Western Blot相比，Cell-based ELISA不需要裂解细胞，直接在微孔板中完成细胞固定、通透与抗体孵育，实现原位、高通量蛋白定量。

• 流式细胞术（FCS）

流式细胞术可以在一个细胞表面进行多个参数的检测，配合数据分析系统可以产生充分且复杂的数据流，明确地排除在单参数试验中的假阳性。另外，流式细胞术可以使用多种荧光染料和探针，可以有更多更灵活的选择。

流式细胞术对于单个细胞的特性分析包括细胞表面或内部抗原表达、亚细胞组件（如线粒体）和细胞动态属性（如蛋白表达变化、钙流以及膜电位、细胞增殖）等。流式细胞术在药物研发与研究中有多种应用，包括生物制剂的PK研究、免疫原性分析中的体外细胞因子释放评价、PD相关生物标志物中特殊细胞群体的免疫表型分型监测和受体占位分析。更详细内容见《生物分析专栏|流式细胞术在生物治疗药物临床生物分析中的应用》。

• ELISpot（酶联免疫斑点）

ELISpot技术可以在单细胞水平上检测细胞分泌的细胞因子或抗体，通过特异性抗体捕获分泌的生物分子，形成可检测的斑点，从而实现对细胞分泌功能的高灵敏度分析。ELISpot技术具有高灵敏度和特异性，能够检测到极低水平的细胞因子分泌，且操作相对简便，适合大规模样本分析。

ELISpot技术在生物分析中的应用广泛，包括细胞分泌功能的评估、免疫反应的监测以及疫苗效果的评价等。例如，它可以用于检测免疫细胞在抗原刺激下分泌的细胞因子，如干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-6（IL-6）等，从而评估细胞的免疫活性。此外，ELISpot技术还可用于研究药物对细胞分泌功能的影响，为药物研发提供重要的数据支持。

• 中和抗体研究

中和抗体水平是评估疫苗保护效力的核心指标，中和抗体能够直接与病毒结合，阻止病毒进入宿主细胞，从而中和病毒的感染能力。中和抗体检测方法有很多种，主要分为直接法和间接法。直接法即通过直接检测病毒的核酸和蛋白来定量样品中的中和抗体的水平，如基于ELISA的中和抗体检测方法、病毒报告基因中和试验。也可以采用间接法，比如细胞感染病毒后会发生细胞融合，从而导致细胞死亡，因此可以通过检测细胞的活率来判断细胞是否被感染。若产生中和抗体，病毒的感染将会受到抑制，则细胞活率升高。间接法有噬斑减少中和试验（Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT）、微量细胞中和试验（Microneutralization Assay, MNA）另外，在蛋白质、多肽、抗体等大分子药物研究中，中和抗体检测可用于评估药物的安全性和有效性，以及预测可能出现的免疫反应风险。

当缺乏特定的天然易感靶细胞或涉及高致病性病原体时，可采用基于细胞转染的替代系统。细胞转染是将外源基因导入细胞的重要技术手段。常用的细胞转染方法包括脂质体转染、电穿孔转染、病毒介导转染等，阳光德美在细胞转染和构建稳定转染细胞株方面具有丰富的经验，可根据不同的细胞类型和实验需求，选择最合适的转染方法，实现高效、稳定的基因转染。

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案例分享

• Jak1抑制剂药效监测-STAT1蛋白磷酸化流式检测

JAK与多种疾病密切相关，尤其JAK1亚型为多条信号通路的共同核心分子，具有丰富疾病谱，以JAK1为靶点的新药研发具有较大的成药价值。全球已有9款JAK1药物获批。某JAK1高选择性的小分子抑制剂为国内企业自主研发且拥有完全自主专利权，拟用于类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病、克罗恩病和溃疡性结肠炎治疗，I期临床试验结果显示该JAK1小分子抑制剂具有良好的治疗效果以及更高的安全性。在I期临床试验中，阳光德美细胞分析平台技术人员应用免疫细胞信号通路激活模型，采用流式细胞检测技术研究了人全血样品中pSTAT1水平，获得的结果为该药PK/PD研究的顺利开展提供了重要的数据支持。

• 流式细胞法检测人外周血中淋巴细胞亚群

RAK细胞免疫治疗是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，杀伤功能增强，然后回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受、激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效，被称为细胞免疫治疗“机械化步兵”。某自体RAK细胞在各实体肿瘤的过继细胞免疫治疗中均表现出明显效果，且具有良好的安全性和有效性，其注射液获批治疗适应症为2线治疗失败的晚期肾癌患者，以及用于预防肝细胞癌外科根治性切除术后患者高危复发。阳光德美采用流式细胞检测技术完成该疗法中人外周血中15种淋巴细胞亚群的检测，以支持该疗法临床有效性的评价。

• PD1受体占位研究

PD1抑制剂与小分子药物联合用药具有巨大的优势。阳光德美采用流式细胞分析技术，分别应用Bond策略和Free策略进行PD1的受体占位研究，可为药物的安全性和有效性研究提供了参考。

• 干细胞功能实验-克隆形成实验

集落形成（CFU）是对造血干细胞与祖细胞分析最为广泛使用的方法之一。用于衡量造血克隆形成能力，证明其有分化血液中具有造血功能的细胞的潜能，是造血功能的恢复的重要指标。某药物是趋化因子受体4（CXCR4）拮抗剂，临床拟申请作为造血干细胞（HSC）动员剂，适用于非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤患者动员HSC进入外周血，以便于完成HSC采集与自体移植。该项目的难点是：CFU的培养需要14天，对细胞操作水平要求极高，此外，对集落类型的判定、以及检测通量问题均具有挑战。阳光德美凭借扎实的技术技能，成功地建立了人全血样品中CFU的定量分析，为该创新药物的有效性研究提供了重要的数据支持。

• 细胞转染

阳光德美采用慢病毒载体转染技术，将表达GLP1受体（GLP1R），GCG受体（GCGR），GIP受体（GIPR）的载体，分别与表达cAMP反应元件CRE调控的Luciferase（荧光素酶，Luc）的载体共转染HEK293细胞，经过稳定筛选，成功构建了HEK293-GLP1R-Luc、HEK293-GCGR-Luc、HEK293-GIPR-Luc单克隆细胞株，可用于GLP1R激动剂、GCGR激动剂、GIPR激动剂的筛选、体外药效评价及中和抗体的检测。

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阳光德美的核心优势

阳光德美拥有符合GLP/GCP要求的生物分析实验室、P2级细胞实验室和PCR实验室。P2级生物安全实验室适用于分析可能含有感染性病原微生物（非高致病性）的样本，通过有效的保障措施，既保护了实验人员与环境，又确保了样本分析结果的准确性和可靠性。

在仪器设备方面，平台拥有高精度的细胞培养箱、流式细胞仪、荧光显微镜等设备，能够满足从细胞培养、转染到检测分析的全流程需求。

专业的技术团队成员均具备深厚的细胞生物学专业知识和熟练的实验操作技能，能够熟练掌握各种细胞生物学技术，并根据不同的研究需求进行技术优化和创新。

同时，平台建立了严格的质量控制体系，对实验的每一个环节进行严格把控，确保实验数据的准确性和可靠性。在细胞实验方面，对细胞的来源、传代次数、培养条件等进行严格控制，确保细胞的质量和稳定性。在实验试剂方面，对所使用的抗体、试剂盒等进行严格筛选和质量评估，确保其特异性和灵敏度符合实验要求。在仪器设备方面，定期对流式细胞仪、酶标仪等设备进行校准和维护，保证数据采集的准确性和稳定性。

阳光德美遵循GLP/GCP规范以及ICH、FDA和CFDA指导原则，已通过了中国合格评定国家认可委员会（CNAS）的认证，同时积极持续参与权威机构组织的流式细胞术能力验证项目，均取得了优异的成绩，显示出卓越的检测能力和质量控制水平。

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结语

阳光德美细胞分析平台以其先进的技术设备、专业的实验团队和严格的质量控制体系，为生物分析领域提供了全面、精准的细胞水平检测服务。从细胞转染与稳定转染细胞株构建、报告基因法、Cell-based ELISA、FCS 细胞表型分析，到细胞因子和受体占位检测等，平台在多个关键技术领域积累了丰富的经验，能够满足不同类型项目的生物分析需求。未来，阳光德美将持续提升细胞分析平台的技术水平和服务能力，为创新药研发贡献更多力量。

（转自：阳光诺和）