（来源：抗体圈）

背景：双特异性抗体（BsAb），作为抗体界的 “跨界高手”，相比传统的单特异性抗体，那可是拥有超多让人羡慕的优势。但它在生产的时候，也特别爱搞出些 “小插曲”，产品异构体频繁出现，这可把下游工艺折腾坏了，带来了超级大的挑战。在这项研究里，我们就好好研究了一下 BsAb 产品及其异构体，在细胞培养液初步回收时，对一组深层过滤器的吸附特性，看看这些过滤器能不能帮忙收拾一下这些 “小麻烦”。

方法：我们先是研究了 BsAb 产品及其异构体，在 Millistak+® D0HC 和 X0HC 这一组深层过滤器上的截留情况，接着又深入探究了它们在深层过滤器上的吸附机理，顺便还研究了深层过滤器的化学和结构特性，以及产品及其异构体的分子特性，从各个角度来揭开它们之间的 “小秘密”。

结果：研究发现，X0HC 过滤器简直是个 “截留小能手”，能截留大量低分子量（LMW）异构体，同时还能 “手下留情”，只截留少量主要产物。而且我们还观察到，这些异构体的截留水平各不相同，这和它们不同的疏水性、电荷特性，以及所用深层过滤器的吸附特性都有着密切关系。进一步研究发现，静电、疏水和氢键相互作用，就是让产物异构体乖乖被截留在深层过滤器上的关键因素，其中 LMW 异构体较高的疏水性，可能让它们成为了被截留的 “优先对象”。

结论：所以，收获深层过滤器说不定真能用来截留 BsAb 异构体呢，不过这得看产品及其异构体的相对分子特性，还有所用深层过滤器的吸附特性，它们之间得 “对上眼” 才行。

简介

双特异性抗体（BsAb），这可是抗体界的 “新起之秀”，属于一类新型抗体。它厉害就厉害在，能同时结合两个不同的表位或靶点，就像有两个 “小雷达”，能同时锁定不同目标。这可让它在疗法上比传统的单特异性抗体有了更多优势，一下子就吸引了超多关注。到现在，已经有 110 多种 BsAb 候选药物进入临床试验阶段，还有三种 BsAb 产品成功上市，混得风生水起。

到目前为止，被报道出来的 BsAb 形式超过 50 种。虽然形式多样，但都可以归为基于片段、基于对称和基于不对称这几种形式。不过，它在生产的时候可就没那么顺利啦。在多达四种多肽共表达的过程中，总会产生各种产物异构体，这些就像是不受欢迎的 “小捣乱”，作为不良副产物出现，比如错配、聚集或片段异构体等等。

这些产品相关杂质一起出现，可把后续的下游工艺给难住了。下游工艺一般是基于现有的单克隆抗体（mAb）纯化技术，然后根据这些杂质和主要 BsAb 产品之间不同的理化性质来改进。基于层析法的工艺一直是 BsAb 纯化的 “主力军”，特别是利用亲和力、离子交换、疏水相互作用（HIC）和混合模式层析法（MMC）来去除 BsAb 产品相关杂质，发挥了很大作用。

深层过滤在生物制剂纯化过程中也是常客，它主要负责去除不溶性颗粒，就像个“大扫帚”，把大块的垃圾清理掉。不过，它去除可溶性杂质的能力机制，大家了解得还比较少。各种标称孔径等级的收获深层过滤器，一般是用来截留各种尺寸的细胞和细胞碎片的。但你可能不知道，具有某些吸附特性的深层过滤器，还能帮着截留与工艺相关的杂质，比如宿主细胞蛋白（HCP）和 DNA，还有那些不需要的产品相关杂质，像高或低分子量（HMW，LMW）异构体。

之前就有报道，使用一组 Millistak+® D0HC 和 X0HC 深层过滤器，在收获过程中去除 mAb 的 HMW 和 LMW 异构体。Yu 等人通过分子建模，把这些产品相关杂质的截留，归因于与过滤介质的疏水相互作用（HIC），还说收获过滤过程中静电相互作用的影响最小。不过呢，对于结合机制，还缺乏系统的实验研究。

在我们这项研究里，就专门研究了 Millistak+® D0HC 和 X0HC 深层过滤器，在收获过程中截留 BsAb 分子（我们在本文叫它 BsAb1）的 LMW 片段的能力。通过一系列实验，评估了 LMW 异构体和产品在深层过滤器上的截留情况，就是为了直接研究过滤器上的吸附机制。然后还评估了产品及其异构体的分子特性，用来解释我们得到的吸附数据。异构体和过滤器结合的强度和机制，和所涉及分子的性质，还有所用过滤器的特性都有关系。所以，了解这些特性，对设计强大的深层过滤工艺，截留可溶性杂质很有帮助。据我们所知，这可是第一项关于在 BsAb 纯化过程中，应用深层过滤去除不需要的产品异构体的研究，是不是很厉害！

结果

收获深层过滤过程中 BsAb1 异构体的截留

咱们要聊的这位主角，是抗体界的 “非主流选手”——BsAb1。这家伙长了个 2+1 的不对称身材，活像个三条腿的凳子，好在分子量 168 kDa 的体格还算标准，等电点 7.8 的酸碱体质也不算太挑。它最特别的是有两个 “相亲专用” 结合区，咱们姑且叫它们 “小 a” 和 “小 b”，就像抗体界的左右护法。

先请看图 1 的 “证件照”，这张全家福不仅拍了 BsAb1 本人，连它那些在细胞培养时偷偷 “克隆” 出来的异构体兄弟都入镜了。照片里标着 “Fab” 的部分是重点，相当于抗体的 “作战手套”，既有识别抗原的可变区，又有保持队形的恒定区，可谓是功能齐全。

图1. CCF中存在的BsAb1分子及其共表达异构体。实线表示肽内和肽间二硫键。二聚体异构体中的分子内键未知，虚线仅用于说明。

接下来是实验室的 “闯关环节”。我们用 D0HC 和 X0HC 滤膜组搭了个 “安检通道”，BsAb1 的细胞培养液（CCF）得从这儿过。根据 D0HC 滤膜的 “工作量” 计算，每平方米居然能处理 70 升样品，这效率堪比机场的快速安检通道。过关后的样品（DF 池）、刚从细胞培养液里 “捞” 出来的样品（Centr. CCF），还有最终纯化的样品（DS），都得接受 “SDS-PAGE” 体检。

体检报告如图 2 所示，A 和 C 是 “非还原” 状态的照片（相当于抗体们穿着外套），B 和 D 是 “还原” 状态的（相当于脱了外套的素颜照）。从图 2A 能看出，Centr. CCF 样品里混进了不少 “小个子” 异构体，按体重分三类：轻链（LMW 1）、轻链二聚体（LMW 2）、同型二聚体或其他小个子（LMW 3）。这些小个子加起来占了 19%，比 DF 池样品的 7% 多不少，看来滤膜安检确实拦下了不少 “可疑分子”。而 DS 样品里，BsAb1 单体占了 99% 以上，堪称 “纯爷们”。

图2.使用D0HC/X0HC滤膜组在(A)非还原和(B)还原条件下，对BsAb1收获物进行深层过滤获得的“Centr. CCF”和“DF Pool”样品的SDS-PAGE图像。(C)非还原条件下LMWs的组成谱带强度分析，(D)还原条件下LCs和HCs的组成谱带强度分析。

再看还原状态的图 2B，二硫键这 “胶水” 断了，重链和轻链各自分开，出现了三个主要条带：knob-HC（约 71 kDa，像个壮汉）、hole-HC（约 50 kDa，中等身材），还有小 a 和小 b 的轻链（都是约 25 kDa，像对双胞胎，所以在图里重合了）。有意思的是，Centr. CCF 样品里的轻链含量最高（图 2D），看来这家伙一开始确实带了不少 “小跟班”，这和非还原状态的结果能对上。

为了进一步确认这些 “神秘人物” 的身份，我们又用 LC-MS 给它们做了 “DNA 鉴定”（图 3）。在 UV280 nm 色谱图上，两个样品里都有五个主要峰，分别对应 BsAb1 单体、同型二聚体、a-LC 二聚体、a-LC 和 b-LC。明显能看出，DF 池样品里小个子异构体的峰（特别是 a-LC 和 a-LC 二聚体）比 Centr. CCF 的小，总小个子含量分别是 7.8% 和 18.5%，这说明滤膜安检确实把不少小个子拦在了外面，和 SDS-PAGE 的结果一致。

不过也有奇怪的地方，hole-HC 同型二聚体在两个样品里的峰差不多大，按理说滤膜没拦住它，但图 2A 的非还原照片里却显示它被拦了一些。这是因为 LC-MS 的峰里可能混进了其他小个子，导致 “计数不准”，看来这鉴定技术也有 “看走眼” 的时候。

另外，图 3 里还有几个小峰是 b-LC 相关的异构体（b-LC、b-LC 二聚体、b-LC/a-LC 二聚体），因为和 a-LC 的小个子们体型差不多，在非还原的 SDS-PAGE 里就混在一起了，形成了图 2A 里的 LMW1 和 LMW2 条带。好在这些小家伙数量不多，滤膜拦不拦影响不大。

图 3 里还有些在 4 到 7 分钟之间洗脱的 “不明物体”（可能是细胞培养基的成分），在 Centr. CCF 里占 7.1%，到 DF 池里只剩 1.9% 了。不过这些 “路人甲”数量太少，咱们就不深究了。

图3.使用D0HC/X0HC 过滤器系列通过 BsAb1 收获深层过滤获得的“Centr. CCF”和“DF Pool”样品的 LC-MS UV280 nm 色谱图。

总的来说，这些数据告诉我们，深层滤膜就像个精明的门卫，能根据小个子异构体的 “长相” 决定拦不拦，从而改变 CCF 里的成分，给后续的纯化工作减轻不少负担。看来给抗体 “安检”，也是门技术活啊！

每个深层过滤器上 BsAb1 异构体的截留能力

为了搞清楚 D0HC 和 X0HC 这两张滤膜到底有多会 “抓东西”，我们从 500L 的 BsAb1 “大桶” 里取了经过离心处理的 CCF，让这俩滤膜各秀了两把操作。先把 CCF 放到离心机里 “甩” 10 分钟（转速 1000g），取上层清液当 “食材”。

实验安排还挺讲究：一次让 D0HC 单枪匹马上阵，另一次则让它和 X0HC 组队，俩 “人” 的 “地盘”（面积）一样大。给它们 “喂料” 的量，按主滤膜面积算，最多能给到 70 L/m²。两次实验都收集了滤液，然后用非还原 SDS-PAGE 这招 “照妖镜”，通过凝胶上条带的 “浓淡”，来看看滤液和原始进料里都藏着些啥。

结果出来一看，D0HC 单独干活时，还真把三种主要的 LMW 异构体（同型二聚体、a-LC 和 a-LC 二聚体）给拦下了（看图 4A）。可换成 D0HC/X0HC 组合后，前几波滤液里的这些 “小调皮” 被拦得更狠（看图 4B）。但喂料一多，过滤器就慢慢 “吃饱” 了，最先 “溜” 过去的是同型二聚体。

图4.BsAb1 离心 CCF 滤液组分的非还原 SDS-PAGE 图像，经 (A) D0HC 滤膜和 (B) D0HC/X0HC 滤膜过滤。(C) BsAb1 产物及其 LMW 异构体经 D0HC/X0HC 滤膜过滤后的穿透性分析，以及 (D) BsAb1HMW 异构体经 D0HC 和 D0HC/X0HC 滤膜过滤后的穿透性分析。

对比凝胶图像就看得明明白白：抓这些 LMW 异构体，主要是 X0HC 在出力，D0HC 基本是 “打酱油” 的。再看图 4C，这是 D0HC/X0HC 滤液里 LMW 异构体的 “阵容”（根据图 4B 的条带强度算的，还跟离心 CCF 的原始组成校准过）。发现 a-LC 和 a-LC 二聚体比同型二聚体 “抓得牢” 多了，喂到 70 L/m² 时，也就约 33%“漏网”，而同型二聚体早就全 “跑光” 了。

另外，过滤时 BsAb1 单体的标准化组成超过 1.0，这说明啊，深层过滤器专抓 LMW 异构体，顺带还提高了 BsAb1 单体的 “纯度值”。

我们还瞅了瞅工艺里的 “不速之客”——HCP、DNA 这些杂质，还有 HMW 异构体的下场。HCP 和 DNA 在 D0HC 和 X0HC 那里都变少了，尤其是 X0HC，抓它们抓得更凶。HMW 异构体也是 X0HC 吸附得更带劲（看图 4D）——D0HC 单独上时，截留率低得可怜；换成 D0HC/X0HC 组合，这些家伙要 “突破防线” 可就难多了。

不过得提一嘴，进料里的 HMW 本来就少得可怜（才～1.1%），所以咱们这研究主要还是盯着怎么用深层过滤把这些 LMW 异构体给清掉。鉴于 D0HC 对各种 BsAb1 异构体的 “吸附力” 最差，接下来的实验，咱们就专门研究研究 X0HC 到底是咋 “抓” 东西的。

BsAb1在X0HC滤膜上的吸附机制

要说研究这 BsAb1 和它的 “小伙伴们”（a-LC、a-LC 二聚体、同型二聚体这些低分子量异构体），那可真是有点费脑筋 —— 这群小家伙长得太像，想把它们一个个拎出来研究 “黏合套路”，难度堪比在一群双胞胎里认人。所以咱们换了个思路：先盯着 BsAb1 产物，看它在 X0HC 滤膜上是怎么 “安家” 的，顺便扒一扒这背后跟工艺条件、分子自身特性有啥关联。

接着，咱们又仔细瞅了瞅 BsAb1 的 LMW 异构体们的 “长相”（分子特性），跟 BsAb1 本尊比了比 —— 毕竟得搞明白，为啥它们在滤膜上 “留不留得住” 的脾气差这么多。

为了搞清楚 “静电吸引力” 在里头捣了多少鬼，咱们做了一连串实验。先给 BsAb1换了身 “缓冲液衣服”：把原来的 Ds 缓冲液换成加了不同浓度 NaCl 的磷酸盐缓冲液（配方：20 mM NaH₂PO₄，pH 7.2），得到了一批纯化的 BsAb1 “样品兵”。然后把这些 “兵” 派到 X0HC 滤膜上，浓度最高到 44 L/m²，接着用缓冲液 “追” 它们 —— 直到 UV280 nm 监测仪说 “没动静了” 才停。每次 “追” 用的缓冲液，离子强度都跟 “兵源”（进料）差不多。最后还得用 1 M NaCl 给滤膜 “洗个澡”，确保那些靠静电 “黏” 住的家伙都被冲下来。全程操作都保持在 50 LMH 的 “速度档”。

结果嘛，图 5A 和 5B 都记着呢：进料里盐加得越多，BsAb1 就越心急，早早地就 “溜” 过滤膜跑到滤液里（图 5A），上样和 “追逐” 阶段收集到的量也更多。反过来，用 1 M NaCl 冲洗下来的量就越来越少 —— 等盐加到≥150 mM 时，冲洗下来的几乎可以忽略不计（还不到上样量的 1%）。这说明啥？静电作用确实是BsAb1 “黏” 在滤膜上的重要原因，但盐够多（≥150 mM）的时候，它就没啥存在感了。

图5.静电相互作用对纯化的BsAb1产物（存在于不同NaCl浓度的PBS缓冲液中）在X0HC滤膜上吸附的影响。（A）上样、追逐和高盐冲洗步骤中滤液的UV280nm色谱图。（B）不同过滤步骤中的产品回收率。

巧的是，BsAb1 的 CCF 物料离子强度差不多就是 150 mM NaCl—— 看来收获时的深层过滤里，静电作用并不是 BsAb1 “赖” 在 X0HC 滤膜上的主因。可有意思的是，就算加了 500 mM NaCl（理论上静电作用早该歇菜了），最后也只回收了 88.5% 的 “兵”，剩下的 11.5% 还是死死 “扒” 在滤膜上。这就明摆着：除了静电，肯定还有别的 “吸引力” 在帮忙。

那会不会是 “疏水小情愫”？咱们又试了试：拿不同有机溶剂给单独装的 X0HC 滤膜 “洗澡”，用 UV280 nm 看看能冲下来多少。实验步骤是这样的：先给每个滤膜“喂” 125 g/m² 的纯化 BsAb1（泡在含 150 mM NaCl 的 PBS 缓冲液里），再用背景缓冲液 “追” 一遍，然后换溶剂 ——30% 丙二醇、10% 乙醇，还有浓度从 0 到 25% 慢慢涨的乙腈，目标是冲掉靠疏水作用 “黏” 住的分子。

结果挺意外：三种溶剂洗下来的量都少得可怜。要么是疏水作用在这儿纯属打酱油，要么就是这吸附机制太复杂，单拆疏水这一环根本没用。当然啦，为了不让 “黏” 在滤膜上的 BsAb1 变性，咱们也没敢用浓度太高的有机溶剂 —— 总得给人家留条活路嘛。

使用盐和流动相改性剂回收吸附在X0HC过滤器上的纯化BsAb1产品

想知道 BsAb1 和 X0HC 过滤器之间到底藏着什么 “小秘密” 吗？我们决定对这对 “难舍难分” 的搭档展开深入调查，看看它们之间的各种相互作用究竟是怎么回事。于是，我们拿出了 1M NaCl、1M 精氨酸和 2M 尿素这几种 “审讯工具”，分别对预装过滤器上结合的分子进行 “冲洗拷问”。实验中用的 BsAb1 可是在含 150mMNaCl 的 PBS 缓冲液里精心纯化过的 “主角” 哦。

说到尿素和精氨酸，那可都是液相改性剂里的 “明星选手”，在层析系统中那是相当给力，既能提高蛋白质分离的分辨率，又能给蛋白质的稳定性 “加 buff”。尿素堪称 “破坏小能手”，专门对付疏水相互作用和氢键；而精氨酸则是 “全能选手”，凭借自身结构里的亚甲基、胍和羧酸基团这些 “秘密武器”，既能调节疏水相互作用和氢键，还能搞定静电相互作用，本事可大着呢。

表 1（原文里有，这里就不啰嗦啦）详细记录了每次实验的产品回收率，还有尿素和精氨酸那些能引发多峰分子间相互作用的 “长相”。结果一出来，可真有点意思。因为进料流里的盐浓度不算低，所以静电相互作用在这儿基本没什么存在感，这就导致用 1M NaCl 冲洗的时候，费劲半天也只回收了 0.9% 的过滤产品，看来 NaCl 这招在这儿不太管用啊。

换成 2M 尿素呢，情况好点，回收了 4.7% 的过滤产品。这说明氢键和疏水相互作用可能在吸附 BsAb1 分子的时候 “联手发力” 了，而且就像之前用有机溶剂冲洗的研究显示的那样，单靠破坏疏水相互作用，想让结合的蛋白乖乖 “松绑” 可没那么容易，尿素这次也没能 “一招制胜”。

再看 1M 精氨酸，那效果可就不一样了，冲洗深层过滤器的时候，直接回收了 10.1% 的过滤产品，比用 1M NaCl 和 2M 尿素的结果都好，妥妥的 “回收率冠军”。这事儿也不奇怪，毕竟精氨酸能同时削弱静电、疏水和氢键相互作用，这可是它出了名的 “本事”，果然名不虚传。

后来我们又试了用含 2M 尿素和 1M NaCl 的混合溶液冲洗预装的深层过滤器，产物回收率是 7.8%，比单独用这两种缓冲液的时候都高。看来在我们这个研究系统里，它们之间可能存在 “协同作战” 的效果，背后的机制还挺复杂，值得好好琢磨琢磨。

不过还有个有意思的发现，大概 3% 到 6% 的过滤产品就像 “死心塌地” 跟着过滤器似的，就算后来用 0.1N NaOH 再冲一遍，也还是没办法把它们 “请出来”，这执着劲儿也是没谁了。

BsAb1及其异构体的分子特性

咱们来给这段科研内容加点 “笑料催化剂”，看看能不能让这些分子们的故事更接地气：

话说科研界最近在追查一桩 “过滤器截留悬案”—— 为啥 BsAb1 家的 LMW 异构体总爱在 X0HC 过滤器上 “赖着不走”？为了揭开真相，咱们给 BsAb1 产物和它的 LMW 异构体做了个 “性格测试”，重点考察它们的 “表面油腻度”（疏水性）和 “带电脾气”（电荷特性）。

先看电荷这茬（图 6A），用 MOE 软件算出来的结果就像给分子们测了 “等电点脾气值”。BsAb1 本尊在 CCF 环境（pH7.2）下简直是个 “正能量爆棚选手”，带 + 11.4 的正电；相比之下，同型二聚体（+2.9）和 a-LC（+1.3）就显得 “佛系” 多了。不过有意思的是，高盐环境像给 BsAb1 套了层 “绝缘服”，就算带正电也很难被过滤器上的负电部位 “吸住”。至于 a-LC 异构体，那点正电基本可以忽略不计，看来 “静电吸引力” 不是它们赖着不走的原因。

接着轮到 “油腻度大赛”（分析性 HIC 试验），咱们特意选了 BsAb1 下游工艺中 “精纯条带” 里的 LMW 富集样品当选手。图 6B 的 HIC 色谱图就像张 “疏水俱乐部入场券”，四个主要峰对应着不同选手 —— 和图 6C 中非还原 SDS-PAGE 的 “身份照” 一比对，正好是 BsAb1 单体和三种 LMW 异构体没跑了。（顺便说句，样品里的 “杂质路人甲” 如 HCP 和 DNA 都少得可怜，不会干扰比赛公平性）

图6.BsAb1产品与其 LMW 异构体相比的表面疏水性和电荷特性。（A）计算的净有效电荷与 pH 的关系，以及（B）用于相对表面疏水性评估的分析 HIC 测定的 UV280 nm 色谱图。

经过 LC-MS “身份验证”，各位选手的排名新鲜出炉：BsAb1 单体最 “清爽”，19.81 分钟就 “早退” 了；同型二聚体稍微 “油腻” 点，留得久一点；a-LC 更甚，而 a-LC 二聚体简直是 “油腻冠军”，在俱乐部里待到最后。

这结果和图 2A、3 里的 “截留记录” 完美对上了 —— 越 “油腻” 的（a-LC 和它的二聚体）在 X0HC 过滤器上被 “扣留” 得越多。看来 “疏水相互作用” 才是幕后黑手！这发现也不是独一份，其他研究早就发现，抗体家族的 “高低聚杂质亲戚” 总爱和 X0HC 过滤器搞 “疏水小团体”，果然是 “英雄所见略同” 啊。

讨论

BsAb1 产物及其异构体和 X0HC 过滤器这对 “欢喜冤家”。研究结果显示，它们俩可不是简单地碰个面就完事，而是通过静电、疏水和氢键这 “三兄弟” 相互作用，上演了一出 “难舍难分” 的大戏，导致 BsAb1 产物及其异构体被 X0HC 过滤器牢牢 “扣留”。

这复杂的 “扣留机制” 得从两方面说起。一方面是 X0HC 过滤器这 “脾气”，它的特性由自身的结构复杂性和异质性质说了算；另一方面就得看 BsAb1 产物及其异构体这 “长相” 了，它们的蛋白质特性，像大小、疏水性和带电斑块分布这些 “外貌特征”，都在这场 “扣留风波” 中起到了关键作用。

咱们再看看生物过程中常用的深层过滤器，它就像个 “大杂烩”，里面有纤维骨架（通常是纤维素物料做的）、合成或天然衍生的助滤剂，还有把所有元素 “粘” 在一起，给过滤介质当 “顶梁柱” 的带电聚合物粘合剂。深层过滤器在生物工艺中那可是 “常客”，这也让越来越多的研究人员对不同市售深层过滤器的 “家底”（结构特性）和截留可溶性杂质的 “手段”（机制）产生了浓厚兴趣。

最近，就有研究人员用共聚焦显微镜给 Millistak+® D0HC 和 X0HC 滤膜 “拍了照”。结果发现，X0HC 滤膜是个 “双层汉堡”，两层主要含天然硅藻土（DE）助滤剂，就像汉堡里的肉饼，还有少量纤维素纤维当 “配菜”。不过，这两层里有没有聚合物粘合剂这位 “隐形厨师”，就没人说得清了。

再看 D0HC 滤膜，同样是 “双层结构”，但和 X0HC 滤膜比起来，纤维素纤维含量更高，DE 含量更低，活脱脱一个 “素汉堡”。这种 “配方” 的改变，可能让 D0HC 滤膜的标称孔径比 X0HC 滤膜大，就像汉堡的口子开得更大，能容纳的东西看似更多，实则结合表面积更小。孔径大了，结合位点之间的 “距离” 也就远了，BsAb1 产物及其异构体想和过滤介质发生多重 “亲密接触”，机会也就少了。

而且，这两种过滤器用的 DE 颗粒和纤维素纤维的 “型号”（类型和大小）可能不一样，这也让它们的吸附性能 “个性十足”。可关于这点，文献里没细说，制造商也没透露，就像藏了个小秘密。

天然衍生的 DE 成分是个 “多孔达人”，主要由硅（Si）组成，形状、大小、形态和孔隙率各不相同，就像一群形态各异的小海绵。由于二氧化硅结构中存在去质子化的硅醇基团（SiO⁻），所以二氧化硅在 pH>2 的范围内都带负电荷，这就使得带正电荷的物质容易被它通过静电相互作用 “吸” 过去，就像磁铁吸铁钉一样。纤维素纤维也不甘示弱，它结构中的羧基和羟基带负电荷，也能帮着吸附点正电荷物质，算是个 “热心肠”。

这些特性就能解释为啥在较低进料盐浓度下，带正电荷的 BsAb1 产品在 X0HC 过滤器上的截留率会增加（见图 5）。而聚合物粘合剂则带正电荷，像个 “阴离子交换小能手”，能通过静电相互作用吸附阴离子。所以，深层过滤器的静电吸附特性，是由不同过滤元件的结构特性以及它们在过滤介质内的 “排列组合”（组成和分布）共同决定的。

比如说，有研究显示 3M90ZB 深层过滤介质中带正电荷的聚合物粘合剂 “霸占” 了大部分 DE 组分，即便 DE 带负电荷，也导致酸性物质在过滤器上吸附得相对较多。不过，也有一定量的碱性物质被截留，这得归功于它们和依然暴露在外、容易 “交朋友” 的纤维素纤维以及 DE 组分之间的静电相互作用。

与之不同的是，研究发现碱性蛋白在双层 PDH4 深层滤膜上比酸性蛋白更容易被截留，这可能是因为 DE 元件的表面积大，没被聚合物粘合剂 “遮遮掩掩”，有更多机会和碱性蛋白 “亲密接触”。

在收获条件下，X0HC 滤膜对 BsAb1 物种的静电吸附似乎不太起眼，但在低盐条件下（比如病毒灭活后深层过滤），产物及其异构体的电荷特性差异可能就派上大用场了，能让 X0HC 滤膜更好地 “提纯” 目标产物。

其他研究还发现，非静电相互作用（也就是疏水和氢键）在不同深层过滤器的吸附特性中也扮演着重要角色。比如，在冲洗缓冲液中加 5% 的 ACN，从双层 PDH4深层过滤器囊中回收 α- 糜蛋白酶模型蛋白的回收率提高了 19%，这是因为 ACN降低了溶剂极性，增加了蛋白质溶剂化，就像给蛋白质 “松了绑”。

但在我们的研究中，用不同的有机溶剂时，BsAb 产品的回收率却没什么变化，这可能是因为 BsAb1 分子和 X0HC 过滤器之间存在 “多模互动”，疏水相互作用并不是唯一的 “幕后推手”。

有一项关于一系列具有不同物理化学性质的肽在二氧化硅纳米颗粒上吸附的研究发现，静电、疏水和氢键相互作用这 “三兄弟” 各自的贡献，取决于肽的序列和性质、二氧化硅颗粒的表面功能性（亲水性还是疏水性）、肽浓度以及环境 pH 值。和二氧化硅颗粒的疏水相互作用，得归功于二氧化硅颗粒表面结构上硅氧烷桥的存在，就像它们之间有个 “隐形的钩子”。

除了助滤剂中的二氧化硅，聚合物粘合剂也可能对非静电相互作用有很大影响，这就得看它的化学性质、成分以及在过滤介质内的分布了。通常来说，粘合剂是个 “hydrophobic（疏水）又带正电的主儿”，但由于它的详细信息是 “商业机密”，咱们也没法知道它对 X0HC 过滤器非静电吸附性能的具体影响，只能猜猜了。

和单独用 NaCl 以及有机溶剂相比，用精氨酸和尿素从 X0HC 过滤器中回收 BsAb1 产物的回收率更高，这也说明 BsAb1 分子很可能是通过多种相互作用的 “组合拳” 被截留的，而不是单一的 “独门绝技”。

关于尿素和精氨酸在复合模式阴离子交换层析中影响的研究发现，由于存在多模式相互作用，在相关条件下，具有多种理化性质的蛋白质的吸附，比在强阴离子交换填料上的吸附更强，就像被粘得更牢了。洗脱调节剂尿素（2M）或精氨酸（0.1M）降低了从复合模式阴离子交换填料中洗脱蛋白质所需的盐浓度，在其他复合模式层析系统中也有类似的情况。

这和我们研究中的观察结果不谋而合，在后冲洗缓冲液中，精氨酸（1M）从 X0HC 过滤器中的回收率高于尿素（2M，含和不含 1M NaCl），因为尿素通过疏水和氢键相互作用影响蛋白质结合，而精氨酸则通过静电、疏水和氢键这 “三管齐下” 来发挥作用。这说明精氨酸介导的与 X0HC 过滤器组件上的结合位点以及包括 BsAb1 及其异构体在内的蛋白质之间的相互作用，那可是相当复杂。

此外，有报道说抗体在吸附于胶体颗粒或疏水表面时，会 “变身”（发生构象变化），这取决于蛋白质结构和表面特性。特别是抗体在 HIC 填料上吸附时，会发生可逆的构象变化，对于不太稳定的结构域（比如 Fab 和 CH2），变化可能更明显，就像害羞的小姑娘换了个造型。

所以，BsAb1 产物及其 LMW 异构体在 X0HC 过滤器上吸附时，也可能会 “变身”，通过把分子结构内的其他区域暴露给过滤介质表面，可能促进更强甚至不同类型的相互作用。而且，这种 “变身” 带来的熵增益，可能让 BsAb1 分子的解吸变得不那么容易，就像 “爱上了就不想走”。

LMW 异构体的表面疏水性比 BsAb1 产品更高，结构稳定性更差，这可能导致结合的 a-LC 和 a-LC 二聚体的 “变身” 更明显，所以它们在 X0HC 过滤器上的吸附比 BsAb1 产品更强，算是 “爱得更深” 吧。

结论

讲个过滤器界的职场故事 —— 主角是 Millistak+® 家的两位 “员工”：D0HC 和X0HC，任务是给 CCF 物料里的 BsAb1 分子 “整理房间”，把那些多余的 LMW 异构体（简单说就是 “长得歪” 的杂质）清出去。

结果呢？俩过滤器的工作态度差太远了。X0HC 简直是强迫症级别的保洁员，抓杂质一抓一个准，那些产品相关的 “不速之客” 基本都被它拦在了门外；而 D0HC 就佛系多了，截留效果约等于 “象征性摸鱼”，大部分杂质都能从它眼皮底下溜过去。

为啥差距这么大？这得从俩 “人” 的 “体质” 说起。X0HC 的 “骨架” 里主要是 DE 助滤剂的二氧化硅，而 D0HC 靠的是纤维素纤维撑场面。就像有人天生擅长抓细节（表面积大、结合位点密），有人只能粗略扫一眼 —— 结构不同，吸附 “战斗力” 自然不在一个量级。

被 X0HC 重点 “拉黑” 的杂质也挺有特点：BsAb1 分子里的 a-LC 轻链、它的二聚体（相当于 “双胞胎抱团”），还有同型二聚体。为了搞懂 X0HC 为啥对这些家伙 “情有独钟”，我们专门拿纯化的 BsAb1 做了实验，结果发现这事儿比想象中复杂。

首先是 “静电社交圈”：CCF 物料里盐浓度高，大家电荷作用都很弱，就像一群戴了绝缘手套的人握手，谁也不理谁；但盐浓度一降，电荷的 “存在感” 就强了 ——有趣的是，单体产物带 + 11.4 的 “正电性格”，a-LC 却几乎不带电，这意味着在低盐环境下，它们可能会因为 “性格不合” 被分开，简直是天然的 “社交过滤器”。

再看 “脱单实验”：我们试着用尿素和精氨酸给 X0HC “松松土”，想把截留的产物捞回来，结果精氨酸略胜一筹（看来是更懂过滤器的 “脾气”）；但换成有机溶剂上场，好家伙，愣是啥也没捞着，估计是跟过滤器 “气场相冲”。

这说明 BsAb1 和它的异构体被 X0HC 抓住，不是单一原因，而是 “组合拳” 效果 —— 就像有人因为颜值 + 性格 + 才华被喜欢，这里是多种相互作用凑一块儿了。

我们还分析了它们的 “朋友圈偏好”：表面疏水性和净电荷。结果发现 a-LC 二聚体和 a-LC 是 “社牛” 级别的疏水性，同型二聚体排中间，单体产物最 “内向”。这就能解释为啥 a-LC 们更容易被 X0HC “黏住”—— 就像派对上最活跃的人总容易被保安注意到。更绝的是，a-LC 们被吸附后，可能还 “换了姿势”（构象变化），结果跟过滤器贴得更紧了，彻底把单体产物比了下去。

总结一下：只要摸清双抗分子里杂质的 “底细”，再了解过滤器的 “性格”，深层过滤就能帮我们高效 “扔垃圾”。虽然这次主要看它们在收获环节的表现，但这俩过滤器要是去下游其他步骤（比如 VI 后的深层过滤）打工，估计也能凭这套 “识人术”帮上忙，选对过滤器、优化工艺，杂质什么的都不是事儿。不过得提醒一句：换个工作环境（工艺条件），这些相互作用的 “贡献度” 可能就变了，到时候还得重新摸底哦。

原文来源：E.E.Borujeni , W.Jin , C.Shao , et al., Role of harvest depth filtration in controlling product-related impurities for a bispecific antibody. Antibody Therapeutics, 2025.