转自：优宁维抗体专家

今天小优继续为大家介绍使用密度梯度离心的方法（Ficoll,Percoll）分离循环肿瘤细胞（CTC）的策略。

循环肿瘤细胞CTCs简介

1869年，Ashworth,T.R等【1】首次在一例转移性肿瘤患者血液中观察到循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）。CTCs即是指从原发肿瘤或转移灶脱落，进入血液循环系统的肿瘤细胞【2】，如图1。

原发肿瘤释放CTCs进入循环中，大部分CTCs死亡，但是少部分CTCs存活并在远端形成转移灶【9】。

每天每g原位瘤可能会释放多达百万的肿瘤细胞进入血液循环【3】，但大部分因血流剪切力、失巢凋亡、免疫系统识别【4】而被清除，只有极少数（0.01%）【4】【5】存活下来，通过血液或淋巴到达远端器官形成新的转移灶，是肿瘤转移（Metastasis）和复发的重要生物学基础之一。

因此，CTCs是肿瘤精准医疗的重要靶点【6】，作为液体活检（其它如cfDNA、cfRNA、microRNA、外泌体、肿瘤代谢物）重要组成之一，其完整细胞的特有属性，允许通过表型、基因型（如单细胞测序）、细胞功能以及异种移植模型，用于肿瘤早期诊断、疾病进展、复发检测、转移癌监控、肿瘤亚型改变、耐药性研究以及预后评估【7】，促进个体化治疗实施。

此外，CTCs携带了肿瘤的基因组、转录组和代谢组等多组学信息，可用于研究肿瘤微环境、转移微环境PMN、免疫逃逸机制，还可用于培养类器官【8】进行体外药物筛选和检测。

CTCs的分离方法

CTCs的分离方法，主要分为非标记法和标记法，如图2。

图2：CTCs分离、培养和分析方法【10】

非标记法

主要依赖CTCs自身的物理性质，如大小、密度、粘附、介电性质和变形性【11】【12】。被广泛使用的Cytiva Ficoll-Paque 和Percoll分离液即基于密度分离。大小和变形性等则常用于微流控技术【13】。

标记法

主要为阳性富集（如上皮细胞粘附分子EpCAM【14】、HER2、束丝蛋白3【15】、前列腺特异性抗原PSA【16】等或Cocktail）和阴性富集（如CD45抗体去除白细胞、CD61去除血小板和巨核细胞【17】、CD14等或Cocktail）。

基于抗EpCAM免疫磁珠技术的CellSearch CTC Test方法，是目前唯一被美国FDA批准作为肿瘤预后评估工具用于转移性乳腺癌（2004年）【18】、结直肠癌（2007年）【19】和前列腺癌（2008年）【20】。

中国CFDA在2012年批准了CellSearch系统用于转移性乳腺癌的预后评估。其它本土获批产品包括CytoSorter循环肿瘤细胞检测系统等，更多检测方法也在兴起和验证中。

CTCs的分离也可以联合非标记和标记法【21】，并受到肿瘤类型的影响【17】。

但是，CTCs分离仍面临挑战：

肿瘤细胞本身即具有异质性。并且，CTCs因上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）失去极性和黏附性，获得更强的迁移和侵袭能力，与基质互作并抵抗治疗，同时表现出上皮和间质表型【22】，也造成细胞表面Marker的动态变化。此外，CTCs还会和血液中其它细胞如白细胞形成CTC微血栓促进自身生存和转移。

CTCs在血液中的密度很低，~1-10 CTCs/mL血液【10】，分离富集挑战大。一般，转移性癌症中每10 mL血液中有0-100个单体CTCs以及0-5个CTCs Cluster（CTCs簇），并与癌症类型、血液收集位置以及治疗阶段有关【23】。CTCs半衰期通常只有 1.0‑2.4 h【24】。

使用密度梯度离心法分离CTCs

早在1959年，Seal SH等【25】即使用硅油配制密度梯度离心介质，分离血液中的游离肿瘤细胞。

目前，商品化的梯度介质，如Cytiva的Ficoll-Paque进行CTCs的分离，在临床研究中被广泛使用【21】【26】【27】【28】。

作为非标记的分离方法，利于富集表面Marker表达异质性CTCs以及未知CTCs亚型，操作简单、低成本、快速，处理通量大。

使用密度梯度介质分离CTCs，文献报道中主要包括4种方法：常规标准操作、抗体预先结合杂质细胞、抗体预先结合CTCs目的细胞，以及使用Percoll不连续密度梯度进行分离。

使用Ficoll-Paque进行CTCs分离的常规操作

根据斯托克斯定律，如图3，颗粒的沉降速率v，和颗粒直径（d）、样品密度（ρp）和溶液密度（ρl）之差成正比；与溶液的粘稠度（η）成反比。当不同细胞经过同一密度离心介质，不同颗粒直径和密度的细胞，沉降速率不同，从而被分开。

外周血中，红细胞、粒细胞密度大【38】如图6，穿过Ficoll-Paque密度梯度介质（1.077 g/mL）沉于底层；外周血单个核细胞PBMCs和CTCs密度小，一起停留在白膜层（buffy coat）中，最上面是血浆。

后续可以使用阳性富集【29】或阴性富集（如anti-CD45磁珠去除白细胞）【30】【39】进一步回收CTCs。

图3：颗粒沉降速率公式【31】

Ficoll-Paque密度梯度介质标准操作及细胞分布，请参考文章：

抗体结合杂质细胞后，再使用密度梯度介质分离CTCs

在密度梯度分离之前，进行杂质细胞预标记，促进其沉降。例如采用anti-CD45（白细胞共同抗原）【8】【32】【33】、anti-66b（粒细胞）与样品进行孵育，使白细胞与红细胞形成免疫玫瑰花状结构，密度和大小增加，在后续密度梯度离心过程中，将白细胞群拉到管底，则在白膜层可以回收更纯的CTCs，如图4，少量CTCs可能会渗漏到血浆层，也可以一起回收【6】【32】。

相对于阳性筛选，基于去除白细胞的阴性筛选更有优势，避免了使用抗体激活CTCs以及某些CTCs因为不表达相应的抗原而被遗漏【32】。

将血液和白细胞抗体如RosetteSep抗体孵育，使用DPBS+2% FBS稀释血样，然后小心地铺到Ficoll-Paque 密度梯度介质上面，离心（关闭刹车）后在白膜层收获CTCs【32】。

抗体结合目的CTCs后，再使用密度梯度介质分离CTCs

在密度梯度分离之前，进行CTCs目的细胞预标记，促进其沉降。

Huang Q等【34】使用同时偶联anti‑EpCAM抗体和anti‑CD146抗体（后者作为肿瘤标志物以及上皮间质转化EMT诱导剂，利于捕获EpCAM无/低表达间质CTCs）的SiO2微珠（表面包被可降解明胶），先和血样孵育以结合CTCs，之后将样品铺在Cytiva Percoll密度梯度介质（配制成1.15 g/mL）的表面，离心，CTCs结合在微珠表面而沉降于管底，之后酶解表层明胶释放CTCs，结果显示CTCs收率＞80%，纯度大于85%，如图5。

也可以使用Ficoll-Paque密度梯度介质，采用类似方法离心沉降CTCs目的细胞，收集管底组分并裂红，回收CTCs。

A：通过可降解明胶包被的微珠（偶联了anti-EpCAM和anti-CD146抗体），高效吸附CTCs。 

B：经过Percoll密度梯度离心，将结合CTCs的二氧化硅微珠沉淀到管底，从而和血细胞分离。

C：通过基质金属蛋白酶MMP-9酶解明胶，释放结合在微珠表面的CTCs。

除了CTCs单细胞外，CTC Cluster【35】以及CTCs与其它血液成分组成的细胞团，往往具有更高的转移潜能。由于细胞团的密度更大，容易在离心后沉降，也可以采用类似方法进行分离，或使用Cluster-Chip【36】。 

另外，具有干性的CTCs，即循环癌干细胞（Circulating Cancer Stem Cells，CCSCs）同样值得关注。

（转自：优宁维抗体专家）